Károli Gáspár legjelentősebb munkája a Biblia első teljes magyar fordítása, amit 1586-ban kezdett meg, Mágocsy Gáspár Torna vármegye főispánjának, valamint annak unokaöccsének, Mágocsy Andrásnak a támogatásával. A pártfogók 1586-ban, illetve 1587-ben bekövetkezett halálát követően Rákóczi Zsigmond, a későbbi erdélyi fejedelem karolta fel a bibliafordítás ügyét. Hat református lelkésztársa segítségével hamar elkészült a fordítással. A Károlyi-biblia nyomtatását 1589. február 18-án kezdték el és 1590. július 20-án fejezték be, így a fordítás után négy évvel a magyar nyelvű Szent Biblia Vizsolyban nyomtatásban is megjelent, 700-800 példányban. Mára 54 példány maradt fenn, ebből 24 található Magyarországon.
Károli tisztában volt az elkészült mű hibáival. Erről ő maga a következőképpen írt a Biblia előljáróbeszédében: "Bizonynyal tudom és semmit sem kételkedem, hogy ezen mi munkánknak, minekutána emberek közé az kimegyen, sok irigye és sok rágalmazója lészen. Mert miképen az testet követi az árnyék, azonképen a virtust az az a jóságos cselekedeteket követi az irigység. Es akik az rágalmazásra születtek, mivelhogy a más ember munkájához, vagy cselekedeteihez hasonlót nem cselekedhetnek, ha különben annak nem árthatnak, rágalmazzák azt. Mindazáltal senkinek sem irigységével, sem rágalmazásával nem gondolok; mert az Isten és az én jó lelkiösmeretem nekem bizonyságom, hogy nem egyebet, hanem a nagy Istennek tisztességére, s az ő házának épületére néztem a dologban." Annak okáért minden keresztény olvasót kér, hogy munkájáért ne rágalmazzák, meg ne keserítsék, hanem nagy isteni félelemmel és hálaadással vegyék és olvassák e magyar nyelvre fordított Bibliát; netaláni fordításbeli hibáit jegyezzék meg és őt intsék meg, hogy a míg Isten e testben tartja, megjobbíthassa. "Szabad mindennek az Isten házába ajándékot vinni... én azt viszem, a mit vihetek, ti. magyar nyelven az egész Bibliát."
Károli azonban már nem tudta a Bibliát újra kiadni, mert nem sokkal a Biblia elkészülte után meghalt. 1608-ban az egykor Göncön tanuló, Szenczi Molnár Albert készítette el a javított kiadást, a Hanaui Bibliát.